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siRNA干擾載體構建與引物設計

  • 發布日期:2014-08-08      瀏覽次數:3430
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      siRNA干擾載體構建與引物設計

       

      siRNA干擾載體構建過程中針對siRNA設計的引物是怎么設計的?

      一般是合成一對引物,然后退火,再與線性化的載體做連接。由于引物比較長,所以合成時一般都會有比較多的堿基突變,因此,做shRNA表達載體構建的主要難度,在于篩選出正確的克隆,有時候可能要選很多個克隆測序才能篩到想要的。具體的序列組成,一般是sense-loop-antisense。不同的公司會有不同的設計原則的。

      經驗:我們一般不去考慮構建載體來得到siRNA!
      載體表達siRNA方法主要存在以下缺點:
      1、外源導入shRNA的表達會干擾細胞本身miRNA的正常表達,而miRNA在基因的表達調控方面有著至關重要的作用,目前已經證實很多疾病的產生通miRNA的表達異常存在確切關系,已有很多文獻報道和證實;
      2、載體構建的周期長,操作較為復雜,試驗重復性不好,做過的人應該大多都知道;
      3、載體用于體內試驗的毒性非常大,容易激發機體強烈的免疫應答反應,副作用大,已有多篇文獻證實;
      4、通量低,影響因素更多,體內試驗的效果很差,存在安全性的問題;
      5、shRNA的表達在時間和表達量上都較難控制等。
      這也是為什么現在10多種進入臨床試驗的RNAi藥物幾乎都是用化學合成的siRNA來做的原因!

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