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上海熒光定量PCR檢測

簡要描述:上海熒光定量PCR檢測于1996年由美國Applied Biosystems公司推出,由于該技術不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,它具有特異性更強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點,目前已得到廣泛應用;實時熒光定量

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  • 更新時間:2024-05-13
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上海熒光定量PCR檢測的方法:

  熒光定量PCR所使用的熒光化學可分為兩種:熒光探針和熒光染料。而熒光定量 PCR 的方法相應的可分為特異類和非特異類兩類,特異性檢測方法是在PCR反應中利用標記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測產物;而非特異性檢測方法是在在PCR反應體系中,加入過量熒光染料,熒光染料特異性地摻入DNA雙鏈后,發射出熒光信號。前者由于增加了探針的識別步驟,特異性更高,但后者則簡便易行。

上海熒光定量PCR檢測zui常用的方法是DNA結合染料SYBR GreenⅠ的非特異性方法和Taqman水解探針的特異性方法,在這里主要介紹這2種方法,其它方法請參考其它熒光定量PCR資料。

  1、非特異性SYBR Green I染料法

  SYBR Green I是一種結合于所有dsDNA雙螺旋小溝區域的具有綠色激發波長的染料(結合示意圖),在游離狀態下,SYBR Green I發出微弱的熒光,但一旦與雙鏈DNA結合后,熒光大大增強(作用機理圖)。因此,SYBR Green I的熒光信號強度與雙鏈DNA的數量相關,可以根據熒光信號檢測出PCR體系存在的雙鏈DNA數量。

  2、特異性Taqman水解探針法

  Taqman熒光定量技術是以Taqman熒光探針為基礎,Taqman熒光探針為一寡核苷酸,兩端分別標記一個熒光發射基團和一個熒光淬滅基團。探針完整時,發射基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;

PCR擴增時,Taq酶的5’-3’外切酶活性將探針酶切降解,使熒光發射基團和熒光淬滅基團分離,從而熒光監測系統可接收到熒光信號,即每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成*同步。從而實現定量(如下圖)。常用的熒光基團是FAM, TET, VIC, HEX。

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